Mario en Luigi trekken samen met Princess Peach en Toad de ruimte in voor een groots avontuur buiten het Mushroom Kingdom. Wanneer ze daar de mysterieuze Rosalina ontmoeten, raken ze verwikkeld in een strijd tegen Bowser en zijn zoon Bowser Jr., die alleen over het universum willen heersen. Tijdens hun reis langs verschillende planeten moeten ze samenwerken om vader en zoon te stoppen.